Samantha Mathis interpretó a Olivia Goodspeed en "The Man Behind the Curtain".

El rol más famoso que Mathis representó fue el de Maria Castle, la esposa del protaginosta Frank Castle, la película de 2004, The Punisher. Ella también apareció en algunas de las series televisivas más populares de los Estados Unidos, incluyendo House M.D. y Law and Order: Criminal Intent.

Mathis co-protagonizó con Christian Slater en la película de acción Rebelión en las ondas y Broken Arrow, además tuvo un papel protagónico en Super Mario Bros. y la película animada FernGully: The Last Rainforest. Mathis interpretó la versión adulta del personaje de Kirsten Dunst, Amy March en la película de 1994 Little Women.

En 1993 comenzó a salir con River Phoenix, la co-estrella de Esa cosa llamada amor, lamentablemente presenció cuando murió a causa de una sobredosis sobre la acera afuera del club nocturno The Viper Room, ubicado en West Hollywood.